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        凱斯艾生物科技(蘇州)有限公司
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      列舉漆黃素對小鼠帕金森動物模型的相關研究方法

      作者: 來源: 日期:2021/5/27 17:11:05 
             帕金森癥是一種會引起多巴胺神經退化的進行性疑難癥,日本目前約有15~20萬名患者。目前雖有補充多巴胺等的對癥療法,但預防發病或者抑制病情惡化的根 治性療法卻不存在。在PD診斷出來時,多巴胺神經細胞就已經減少了50%左右。因此,亟需開發針對發病前(前驅期)的早期診斷法和新療法。對診斷和新藥開發極為重要的如實再現這種前驅狀態的帕金森動物模型,也隨之備受期待。接下來,帕金森動物模型公司—凱斯艾生物科技就為大家具體分析下。
             材料與方法
             材料
             漆黃素(3, 7, 3', 4'-四羥基黃酮,fisetin)、MPTP(1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氫吡啶)、TH抗體(Sigma,美國);β-actin抗體(proteintech,美國);還原型谷胱甘肽(GSH)、總超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒(南京建成生物,中國);甲苯胺藍染液(Servicebio,美國)。
             實驗動物
             雄性C57BL/6小鼠,12~13周齡,體重24~28 g,由上海南方模式生物公司提供。每籠飼養5只小鼠,自由進食和飲水,相對濕度40%~50%,室溫20~25℃,12 h/12 h晝夜節律。實驗操作流程嚴格遵循中國實驗動物操作指南,已通過上海南方模式生物中心倫理委員會的批準(IACUC: 2018-0005)。
             實驗動物分組及造模
             帕金森動物模型公司說到將小鼠隨機分為3組:control組、MPTP組和漆黃素+MPTP組,每組5只,共15只。MPTP組按照30 mg/kg的劑量連續5 d腹腔注射,復制小鼠帕金森動物模型。漆黃素+MPTP組小鼠給予100 ng/kg漆黃素(溶于含1%DMSO的PBS溶液配制)連續灌胃30 d,control組和MPTP組同時給予等量含1%DMSO的PBS溶液灌胃。在漆黃素給藥的第26~30 d,漆黃素+MPTP組給予MPTP連續腹腔注射5 d。
             行為學實驗
             曠場實驗
             實驗開始前,將小鼠放至實驗環境中適應半小時。將小鼠放置于實驗箱(40 cm×40 cm)底部的中央區域。利用曠場工作站(MED Associates, Georgia, VT, USA),連續采集并分析15 min內小鼠的平均速度、運動總距離等指標。
             爬桿實驗
             自制爬桿裝置,并對各組小鼠進行爬桿訓練。MPTP末次注射后的次日進行爬桿實驗。將小鼠頭朝上,上肢放在桿頂端(高80 cm,直徑1 cm)。小鼠從放置到全身朝下的時間為掉頭時間,從放置到后肢著陸的時間為總時間。每只小鼠測試3次,每次測試間隔1 h以上。
             懸掛實驗
             自制懸掛實驗裝置(中間鐵絲直徑2 mm,長50 mm;兩端平臺高35 cm),將小鼠前爪放于鐵絲中間以懸掛小鼠。記錄180 s內小鼠掉落的次數以及到達兩端平臺的次數,并根據參考文獻[9]計算得分。小鼠的基礎分數設為10分,每掉落1次減去1分,到達平臺1次則加1分。帕金森動物模型公司說到小鼠中途掉落或者到達平臺后將其重新懸掛,直至計時達到180 s。
             蛋白免疫印跡
             行為學實驗結束后,對小鼠進行灌注并取材。取小鼠一側新鮮腦組織,將紋狀體剝離并加入適量的含PMSF的RIPA裂解液勻漿后,4℃、12 000 r/min,離心15 min。取上清液,采用BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離蛋白,將分離的蛋白質轉移至0.45 μm的PVDF膜上。5%的脫脂牛奶封閉膜120 min以抑制非特異性結合。隨后按照蛋白分子量裁剪目標條帶,對應TH抗體和β-actin抗體4℃冰箱搖床孵育過夜。次日,TBST清洗3次后,將目標條帶與對應種屬的二抗室溫孵育1 h,蛋白印跡智能成像系統掃描。
             免疫熒光
             取小鼠另一側半腦,放入4%的多聚甲醛中固定24 h后,參考小鼠腦圖譜制備小鼠腦組織黑質區的石蠟切片。將石蠟切片放入二甲苯中脫蠟后,放入不同梯度的乙醇中水合。隨后將切片置于pH 6.0的檸檬酸鈉緩沖液中煮沸修復8 min,用組化筆在腦組織周圍畫阻水圈,向阻水圈內滴加免疫熒光封閉液,37℃封閉2 h后,加入TH抗體于4℃冰箱孵育過夜。次日,PBST清洗后加入免疫熒光二抗,放置于濕盒中37℃避光孵育30 min。用含DAPI的抗熒光淬滅劑封片后,在熒光顯微鏡下觀察。
             尼氏染色
             將小鼠腦組織黑質的石蠟切片依次放入二甲苯和梯度乙醇中脫蠟和水合。在切片上滴加甲苯胺藍染液染色5 min,流水洗凈。加入1%的冰醋酸適當分化后,二甲苯中透明5 min并用中性樹膠封片。
             氧化應激指標測定
             取適量的小鼠紋狀體組織,加入9倍預冷的生理鹽水于冰上制備10%的組織勻漿,隨后3 000~4 000 r/min,離心勻漿液10 min,取上清液并嚴格按照說明書操作,進行氧化應激指標GSH、SOD、T-AOC、MDA的檢測。
             統計學方法
             使用SPSS 21.0軟件和GraphPad Prism 8.0軟件進行統計學分析。計量資料用均數±標準差表示,多組間比較采用單因素方差(One-Way ANOVA)分析。檢驗水準取雙側α=0.05,以P < 0.05為差異有統計學意義。Adobe Illustrator CC 2018繪圖。
             以上就是帕金森動物模型公司—凱斯艾生物科技為大家整理發布的。凱斯艾生物科技(蘇州)有限公司(珂瑪麒)是一家研發關節炎動物模型,肺損傷模型。急性腎損傷模型,心肌梗死動物模型,帕金森動物模型,糖尿病動物模型以及腦梗死模型等,提供專業的臨床前藥理藥效學評價服務。

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